Isolasi DNA Plasmid

BAB I

PENGANTAR

1.1.      Latar Belakang

Plasmid merupakan DNA ekstrakromosom yang dikenal pada bakteri, berutas ganda, dan berbentuk sirkuler (Jusuf, 2001).Plasmid memiliki ukuran yang relatif kecil dan terletak di luar kromosom dalam sel prokariot khususnya bakteri dan sel eukariot tingkat rendah seperti khamir.Plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan Escherichia coli sebagai inang sehingga dalam rekayasa genetika, plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen  tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Pada bakteri Eschericia coli, bahan genetik utamanya terdiri atas sekitar 4.600 kb (4,6 x 10⁶ bp). Plasmid dapat dijadikan sebagai vektordisebabkan  dapat melakukan replikasi, terletak  ekstra kromosom, ditransfer secara stabil, berukuran kecil, susunan DNA sudah diketahui, harus mempunyai jumlah salinan yang banyak di dalam sel inang, memiliki titil Ori, memiliki marker seleksi, memiliki marker kedua yang berguna untuk tanda apabila plasmid disisipkan gen asing, dan memiliki situs retriksi yang unik sebagai tanda untuk menyisipkan gen asing.

Pada dasarnya plasmid merupakan  identitas genetik yang ditemukan secara alami di dalam sel beberapa kelompok prokariot dan eukariot. Dengan teknik rekayasa genetik, sekarang telah dikembangkan plasmid artifisial dengan cara menggabungkan gen-gen dari plasmid alami maupun genom tertentu (Yuwono, 2009).

Pengamatan DNA plasmid dilakukan melalui proses isolasi plasmid, elektroforesis, dan visualisasi menggunakan sinar ultraviolet (UV). Tahapan pengendapan dalam isolasi plasmid adalah pemecahan sel, keluarnya plasmid dari nukleus dan pengendapan atau presipitasi plasmid. Tahapan selanjutnya adalah elektroforesisDNA yaitu teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya dengan menggunakan medan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA plasmid yang bermuatan negatif (Yuwono, 2009). Gel yang biasanya  digunakan dalam proses elektroforesis adalan agarosae. Elektroforesis biasa digunakan untuk analisa ukuran dan konfirmasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi DNA.

1.2.      Tinjauan Pustaka

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleusyang disebut sebagai DNA kromosomal, begitu pula bakteri.Selain DNAkromosomal, bakteri juga memiliki DNA ekstrakromosomal.Plasmid merupakanDNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal.Bentukplasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb.Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupuntidak memiliki plasmid.Plasmid bisa saja tidak terdapat pada bakteri yang biasa sajakarena plasmid tidak mempengaruhi ketahanan hidup bakteri tersebut.Plasmid hanyamemberikan sifat istimewa yang dimiliki oleh bakteri tersebut misalnya resistensiterhadap antibiotik. Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antaralain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication)sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Replikasidimulai dari titik ORI hingga semua plasmid tereplikasi.

Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kuranglebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang pentinguntuk pertumbuhan bakteri. Di alam, gen informasi ini sering mengkode protein yangakan membuat bakteri resisten terhadap antibiotik. Plasmid mungkin merupakan hasildari perkembangan heterotrop yang tertutup. Bakteri sering tumbuh pada lingkunganyang sama dengan mold dan fungi dan berkompetisi dengan mereka untukmendapatkan makanan (bahan organik kompleks). Sebagai hasilnya mold dan fungimenghasilkan toksin untuk membunuh bakteri (dalam dunia kedokteran seringdisebut dengan antibiotik) agar menang dalam memperebutkan makanannya.Untuk menanggapi ini bakteri menghasilkan plasmid untuk mempertahankanhidupnya (Jakubowski. 2008).Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada diluar DNA kromosomal bakteria.DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukariotik yang berada secara simbiotik maupun parasitik pada sel inang.

Berdasarkan fungsinya plasmid dapat dikelompokkan menjadi:

·         Fertility- F plasmids

Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses konjugasi. Plasmid ini juga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Escherichia coli, Pseudomonas sp, dan Streptomyces.

·         Resistance- R plasmids

Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.

·         Plasmid penyandi bacteriocins

Bacteriocins adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini tergantung pada organisme yang memproduksinya.Misalnya plasmid Col pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.

·         Degradative plasmids

Merupakan plasmid yang mampu mencerna subsansi yang tidak biasa, contoh toluen dan asam salisilat.

·         Virulence plasmids

Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen.

Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel dapat dibedakan menjadi:

·         Low copy number plasmid dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau beberapa plasmid saja.

·         High copy number dimana dalam satu sel mengandung banyak plasmid hingga

ribuan. Contohnya bakteri Escherichia coli.

Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain:

·         Supercoiled (covalently closed-circular)

DNA plasmid berbentuk sirkular dengan bentuk rantai yang terpilin.

·         Relaxed circular

Kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.

·         Supercoiled denature

Kedua ujung DNA menyatu tapi pasangan basanya tidak sempurna.

·         Nicked open circular

Rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja.

Berbagai macam bentuk plasmid itu akan mempengaruhi kecepatan migrasi plasmid dalam elektroforesis. Elektroforesis adalah proses migrasi dari fragmen DNA di dalam gel yang direndam dalam larutan penyangga. Urutan migrasi bentuk-bentuk plasmid tersebut dari yang paling cepat adalah supercoiled, supercoiled denaturated, relaxed circular, dan nicked open circular. Bentuk plasmid yang semakin kecil atau ramping akan lebih mudah bergerak melalui pori gel agarose sehingga akan mencapai bagian bawah terlebih dahulu. Perjalanan molekul DNA di dalam gel mengikuti arus listrik, dari kutub negative menuju kutub positif. Semakin besar tegangan arus listrik, perjalanan molekul DNA akan makin cepat, demikian pula sebaliknya. Ada bermacam- macam zat kimia yang digunakan sebagai gel di dalam proses elektrofoesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan denga tujuan yang akan dicapai. Ada dua cara elektroforesis, yaitu elektroforesis gel agarose dengan visualisasi menggunakan ethidium bromide dan elektroforesis gel polyacrilamide dengan visualisasi menggunakan silver staining.

Ada berbagai macam kegunaan dari plasmid, dalam rekayasa genetika, plasmid digunakan sebagai vektor untuk kloning DNA. Selain itu plasmid juga banyak digunakan untuk perbanyakan jumlah DNA tertentu sehingga bisa mengekspresikan gen tertentu. Alasan utama pengunaan plasmid ini adalah karena plasmid memiliki peta restriksi, adanya marker sehingga dapat diketahui apakah gen insert masuk atau tidak, memiliki copy number yang besar, dan mudah dimodifikasi sesuai dengan tujuan tertentu. Karena plasmid memiliki fungsi yang bisa dimanfaatkan keuntungannya, maka ada banyak cara yang digunakan untuk mengisolasi plasmid tersebut. Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) digunakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehinggasemua organel sel dapat keluar.Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNAekstrakromosmal (plasmid).Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukanpemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yangdapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis withdetergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion.

1.3.      Rumusan Masalah

1.      Apakah dapat dilakukan isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli ?

2.      Apakah hasil isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli dapat diidentifikasi dengan elektroforesis Gel Agarose ?

1.4.      Tujuan

1.      Agar mahasiswa mampu mengisolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli.

2.      Agar mahasiswa mampu mengidentifikasi hasil isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli dengan metode Elektroforesis Gel Agarose.

1.5.      Hipotesis

1.      Dapat dilakukan isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli.

2.      Hasil isolasi DNA plasmid dari bakteri Escherichia coli dapat diidentifikasi dengan elektroforesis Gel Agarose.

BAB II

METODE KERJA

A.    Isolasi DNA Plasmid

·         Alat     :

1.      Microcentrifuge ( high speed)

2.      Tabung ependorf 1,5 ml

3.      Rak tabung ependorf

4.      Pipetor /pipetman ukuran 200-1000 μl, 20-200 μl

5.      Tip pipet (warna biru dan kuning)

6.      Sarung tangan

7.      Water bath

8.      Autoclave

·         Bahan :

1.      Kit plasmid  DNA purification (Macherey-Nagel)

·         Cara Kerja :

1.      Menggunakan 1,5 mL kultur E.coli yang telah ditambahkan dalam medium LB + kanamisin selama 18 jam sebagai bahan isolasi plasmid.

Artikel Ini dalam Label: BIOLOGI